簡要描述:DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式,它不改變DNA的一級結(jié)構(gòu),卻在細胞的發(fā)育、基因的表達、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象,而啟動子CpG島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制。因此,基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷(如甲基化檢測與低劑量CT相結(jié)合)、藥物敏感性檢測等方面具有很高的應(yīng)用價值。
DNA CpG甲基化檢測
甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR)應(yīng)用
DNA甲基化在人的正常發(fā)育、X染色體失活、衰老以及許多人類疾病(如發(fā)育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)心理失調(diào)等)過程中發(fā)揮重要作用,已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。
DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式,它不改變DNA的一級結(jié)構(gòu),卻在細胞的發(fā)育、基因的表達、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象,而啟動子CpG島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制。
因此,基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷(如甲基化檢測與低劑量CT相結(jié)合)、藥物敏感性檢測等方面具有很高的應(yīng)用價值。
甲基化特異性PCR法原理(Methylation-specific PCR,MSP)
MSP法的原理是基于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(mC)的一種反應(yīng),在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是*存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是zui主要的甲基化位點,它在基因組中呈不均勻分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域,在哺乳動物中mC約占C總量的2-7%。一般說來,DNA的甲基化會抑制基因的表達;針對特定區(qū)域設(shè)計引物,再進行PCR擴增,甲基化的位點可以被當(dāng)作一個C/T的SNP來處理;可利用直接測序法來判斷是否CpG位點發(fā)生甲基化。具有方便快捷,靈敏度高的優(yōu)點,是目前較為常用的甲基化檢測方法。
MSP實驗流程:
1.基因組DNA制備,樣本類型有:組織,血液,細胞,毛發(fā),唾液等。
2.經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后,未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏t不變。
3.DNA修飾后,進行純化及回收。
4.修飾后的DNA進行PCR擴增。
5.電泳或直接測序檢測
6.實驗報告(包括MSP基因組DNA,PCR產(chǎn)物及電泳照片)
樣品要求
1、基因組DNA(≥1µg),純度(OD:1.9-2.0)
2、若提供的材料為新鮮組織、血液、細胞等生物材料,請?zhí)峁┳銐蛱崛?µg以上基因組DNA的材料量。
3.樣本運輸途中,需要加冰袋,或干冰。