RNAi干擾檢測 是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。基因沉默,主要有轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常轉(zhuǎn)錄;PTGS是啟動了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉(zhuǎn)基因會同時導(dǎo)致TGS和PTGS。
RNAi干擾檢測 主體實驗:
一、成功將siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞
如果目的細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低(低于70%),則應(yīng)采用腺病毒或慢病毒載體,利用病毒載體的高感染率、高表達(dá)特性,更好地開展RNA干擾主體實驗。
二、設(shè)置好分組和對照
按照nature的標(biāo)準(zhǔn),一個嚴(yán)格的RNAi介導(dǎo)knockdown實驗要有6個對照:
⒈轉(zhuǎn)染試劑對照(監(jiān)控轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件對結(jié)果的影響);
⒉nonsense siRNA對照(監(jiān)控外源核酸本身對結(jié)果的影響);
⒊positive siRNA對照(監(jiān)控假陰性);
⒋技術(shù)重復(fù)對照(也叫off-target 對照,也就是利用至少2個靶點的siRNA同時實驗,2個siRNA互為off-target control,當(dāng)兩者的表型相同時,才有可能是特異性的knockdown效應(yīng));
⒌rescue 對照(knockdown之后做超表達(dá),看是否有性狀的逆轉(zhuǎn),這也是為了說明knockdown的特異性);6.全表達(dá)組掃描對照(就是轉(zhuǎn)錄/表達(dá)芯片掃描,以zui終確定表型不是由于off-target造成)。
實際實驗中,全表達(dá)組掃描對照很少有文獻(xiàn)涉及。其它幾個對照中,1,2兩種對照即所謂的空白細(xì)胞對照、NC對照,基本是所有雜志都要求具備的。4,5兩種對照,主要是為了解決off-target效應(yīng),選做一種即可,一般建議選5,涉及的實驗即所謂的“RNA干擾回復(fù)實驗"。
三、RNA干擾效率的檢測(體外)
一般應(yīng)該從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞表型水平三個層次來檢測干擾效率。
mRNA水平:RT-PCR、Real-time PCR;蛋白質(zhì)水平:Western-blot、ELISA、免疫組化;細(xì)胞表型水平:MTT、克隆形成實驗、流式細(xì)胞檢測、細(xì)胞小室實驗等。RNA干擾效率在動物模型上的進(jìn)一步驗證(體內(nèi)) 動物模型實驗可以采取“體內(nèi)法"和“體外法"。
體內(nèi)法,即先做裸鼠成瘤模型,再將質(zhì)粒或病毒導(dǎo)入裸鼠,檢測RNA干擾效果。此法操作復(fù)雜,對質(zhì)粒和病毒產(chǎn)品的質(zhì)和量要求都較高,但是比較貼近實際,說服力較顯著。體外法,即先將質(zhì)粒或病毒導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞,再將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入動物體內(nèi),然后檢測RNA干擾效果。此法操作較簡單,對質(zhì)粒和病毒產(chǎn)品的質(zhì)量要求較低,所以為大多數(shù)文獻(xiàn)所采用。建議采用此方法來進(jìn)行動物模型水平的實驗。